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化學(xué)發(fā)光試劑使用方法及原理
更新時(shí)間：2015-09-02瀏覽：2593次
一、化學(xué)發(fā)光試劑用途：
本試劑是非放射性發(fā)光系統(tǒng)，用于檢測(cè)固定在膜上的蛋白，其敏感性達(dá)1-5pg。用X光片可快速地獲得*的硬拷貝結(jié)果。所含*的底物足以維持12小時(shí)以上的發(fā)光，便于反復(fù)曝光操作，免疫印跡膜經(jīng)抗體脫卸處理后可供再次抗體探查使用。適用于痕量蛋白或核酸檢測(cè)。特別節(jié)省抗體(一抗1:500-1:5000，二抗1:3000-1:10000)。
二、化學(xué)發(fā)光試劑原理：
辣根過(guò)氧化酶使試劑中的發(fā)光物（Luminol）氧化并發(fā)光，而試劑中含有增強(qiáng)劑這使得發(fā)光增強(qiáng)了1000倍。在免疫印跡中，將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到固相膜上（如NC、PVDF）等，用于免疫學(xué)檢測(cè)，經(jīng)HRP標(biāo)記的抗體與膜上的蛋白直接（標(biāo)記一抗）或間接（標(biāo)記二抗）反應(yīng)。當(dāng)加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑后，Luminol發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長(zhǎng)為428nm的光，此光可經(jīng)X光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來(lái)。
三、使用方法：
1. 印跡膜制備 按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜操作，適當(dāng)?shù)姆忾]非常重要。可以通過(guò)標(biāo)記一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交聯(lián)物。仔細(xì)地淋洗對(duì)于降低背景非常重要，在與HRP交聯(lián)物溫育后，膜片更需仔細(xì)洗滌，所有步驟均在室溫下完成。
2. 化學(xué)發(fā)光試劑的配置 在使用前等量混合A液和B液，混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。
3.蛋白信號(hào)顯現(xiàn)
1). 用平頭鑷鉗住膜片，垂直置于吸水紙以吸去過(guò)量試劑。
2). 置膜片于二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡。
3). 將膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中。
4). 于暗室中壓上X光片。
5).根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)*效果。顯影沖洗。
6). 調(diào)節(jié)曝光時(shí)間，再次曝光顯影。
4、膜的重復(fù)使用：
配置62.5mM Tris-Hcl,PH6.7,2%SDS, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液，膜放入后，70?C振蕩水浴30分鐘。再用TBST或PBST緩沖液洗脫，zui后用BSA（牛血清白蛋白）或牛奶封閉。
四、化學(xué)發(fā)光試劑操作注意：
1. 本試劑每個(gè)批號(hào)均獨(dú)立優(yōu)化，請(qǐng)不要混用或稀釋本試劑以免降低敏感性；
2. 加入一抗后膜不能再干燥；
3. 適當(dāng)?shù)胤忾]和洗滌膜片至關(guān)重要；
4. 使用前配置化學(xué)發(fā)光試劑，配置足夠覆蓋膜片即可，棄去使用過(guò)的混合試劑；
5. 使用干凈取樣頭取用每種試劑；
6. *張片子建議曝光1分鐘，觀察結(jié)果后判斷*曝光時(shí)間可從30秒至2小時(shí)不等；
7. 除了放射自顯影片曝光和洗片處理外，所有步驟均不必在暗室中操作；
8. 膜片可經(jīng)適當(dāng)方法洗脫原有抗體，再次印跡使用，在此情況下，此試劑更為理想；
9. 因?yàn)樗幌笊镔|(zhì)需要從膜片上清除底物。
10. NaN3能抑制HRP活性，應(yīng)避免使用NaN3。
